年至年，全球生育率（即每对夫妇的活产数）下降了53%。约40%因男性因素导致不孕。越来越多的证据表明，在过去的50年里，全球男性的生育能力正在下降，精子数量下降了约50%。每六对夫妇中就有一对需要借助辅助生殖技术（ART）来生育孩子。
ART，包括人工授精（IUI）、体外授精（IVF）和显微授精（ICSI）。而使用ART进行不孕症治疗也存在如何选择最优质精子的需求。
精液常规检查是评价男性生育潜能最基本、最重要的检测项目，包含的参数主要有精液量、颜色、pH值、液化程度、粘稠度、精子的浓度、活力、活率、畸形率、圆形细胞数量等等。
从精液常规到精子分选技术，我们来聊一聊精子分析的进展。
传统的精子分选技术，如密度梯度离心、游动试验等，无法筛选出DNA质量最佳的精子。新的技术，如数字全息技术、超分辨率显微镜技术和新一代测序技术，能够改进对精子运动、形态和遗传学的分析，克服了精确性和一致性方面的限制，并改进精子的选择，用于治疗不孕症。
一、精液的外观
正常精液颜色呈均质、灰白色外观。
1.精液比较清亮、透明，说明内含物较少，常见无精子或少精子症。
2.黄色或棕色脓样精液：见于精囊炎或前列腺炎等。
3.鲜红或暗红色血性精液：见于生殖系统的炎症、结核和肿瘤等。
二、精液量
一般来说，成年男性在禁欲2～5天，一次射精量约2～6mL。WHO将精液量参考值下限下调至1.5mL。
1.2ml：慢性精囊炎症、前列腺炎症；前列腺精囊发育欠佳或缺如；苗勒氏囊肿；标本遗撒等。
2.6ml：慢性前列腺、精囊、尿道旁球腺炎症或者功能亢进；
三、液化、粘稠
精液液化时间：室温30～60min
完全不液化：精液标本在60分钟后仍处于刚射出状态（稠厚、凝胶团状）。
不完全液化：精液标本在60分钟时部分液化，部分不液化，呈非均质状态。
粘稠：呈均质性粘稠，无凝胶团状，拉丝长度大于2㎝。
1h内不液化，称为精液迟缓液化症。是男性不育的原因之一。与前列腺、精囊或者内分泌激素水平有关。
四、pH值
精液是一个混合型液体，主要由碱性的精囊液和酸性的前列腺液组成，pH值多在7.2～8.0之间。
1．精液pH值＜7.0，多见于少精或无精症，常反映输精管道阻塞、先天性精囊缺如或附睾病变等。
2．精液pH值＞8.0，常见于急性感染，如精囊炎、前列腺炎等。
五、精子数量
精子浓度波动范围在人与人之间、每次射精之间都有很大差异，而且与禁欲时间长短有关，正常人精子浓度应≥万个/mL或≥万个/每次射精，低于这个标准，成为少精子症，不容易受孕。
精子数量越少，发生不育的风险也就越高。导致少精子症的原因很多，是睾丸的产量出问题了，还是输精管道通畅性差导致的都应进一步检查，对症处理，对治疗效果不佳的患者，可选择ART。
精子少影响生育，精子太多也不见得是好事（＞2.5亿个/ml），太多会增加精子间相互碰撞的机会，导致营养不良。所以精子多多，也未必益善。
无精子症是指连续2次以上精液检查，离心后均未发现精子，包括梗阻性无精子症（OA）和非梗阻性无精子症（NOA）。
六、精子活力分析
活动力下降是导致不育的重要原因之一。常见于精索静脉曲张、泌尿生殖系的非特异性感染如大肠杆菌感染及内分泌激素异常等，某些代谢药、抗疟药、雌激素、氧化氮芥等。
完全无活力可能提示纤毛超微结构异常如卡塔格内综合征和死精子症。
而评价精子活力最有效的指标就是前向运动精子的比例，正常参考值为PR+NP≥40％或PR≥32%。
精子运动由精子鞭毛产生，鞭毛运动进一步由位于鞭毛中心线的轴突驱动。轴突由一对中央微管组成，被9对微管双管和9个外致密纤维包围，形成9+9+2结构。动力蛋白附着在相邻的微管二重体上，并在它们之间施加滑动力，导致鞭毛弯曲和精子运动。
跟踪精子运动轨迹和测定精子活力对男性因素不孕症的临床诊断具有重要意义。通过建立精子运动动力学模型，开发了联合概率数据关联滤波器（JPDAF）方法，获得了更高的跟踪精度。
七、精子形态分析
精子形态包括正常形态精子和异常形态精子（畸形精子或潜在受精能力较差的精子），按照WHO所给出的形态标准，只要正常形态精子≥4%（第五版）或≥15%（第四版）就够用了，也就是说在健康人精液中，异常形态精子比例要远远高于正常形态的的精子。
正常形态的精子是受精功能所必需的。精子由头部、中段、主段和末端组成。头部光滑，一般呈椭圆形；顶体应覆盖头部面积的40％～70%；传统的形态学分析是通过精液涂片的固定和染色来进行的。但是，染色会破坏精子，使其无法用于不孕症治疗。
使用高倍镜意味着可以选择具有正常亚细胞结构的精子，并用于精子形态学选择微注射（IMSI）。差异干涉对比（DIC）成像技术已被用于非侵入性增强精子对比度。干涉相位显微镜可以用来获取精子的三维形态信息，可以获得精子的头部高清轮廓。
八、圆形细胞数量
精液中圆形细胞可能是白细胞，也可能是生精细胞，哪个多了都可能对精液质量造成影响。明确区分圆形细胞类型还是很有必要的，生精细胞多了考虑睾丸的功能出问题了，白细胞多了要考虑炎症反应，应进一步确定感染来源。
九、精子遗传学分析
DNA碎片
精子头部包含的染色体为受精胚胎提供了一半的遗传物质。然而，这些遗传物质容易受到损伤，包括DNA破碎、染色体畸变和端粒缩短。DNA完整性是衡量精子质量的重要指标。
过多的DNA碎片可导致胚胎发育停滞、着床失败、流产和先天性畸形。精子DNA破碎的常见原因包括氧化应激、凋亡和鱼精蛋白表达异常。
在吖啶橙染色后，含有DNA碎片化的精子呈红色荧光，DNA正常的精子呈绿色荧光。采用标准荧光显微镜或流式细胞术对样本进行分析，荧光强度随着单链或双链DNA断裂次数的增加而增加。在经过酸化和核蛋白去除后，在无DNA碎片的精子中观察到分散环。通过电泳，受损精子染色质的DNA碎片从精子头部迁移，显示出一个彗星尾形状。彗星尾部的强度和长度反映了DNA断裂的数量。原有精子DNA碎片检测的染色方法是有创的。
拉曼光谱是一种非侵入性检测DNA碎片的方法。在拉曼光谱中，DNA和鱼精蛋白的信息直接从分子振动引起的非弹性光散射中提取。
染色体分析
精子染色体畸变在不育男性中很常见。2％～14%的不育男性存在一定程度的染色体畸变，染色体畸变程度越高，不育程度越严重与复发性流产和出生缺陷相关。包括染色体数目畸变和结构畸变。荧光原位杂交（FISH）试验使用染色体特异性DNA探针获得核型，从而能够识别染色体数量或结构的变异。
这些探针结合到特定染色体的靶位。但它的分辨率有限，不能用于全基因组的筛选。阵列比较基因组杂交（aCGH）使用设计的探针检测数千个DNA靶点进行全基因组筛选。该技术可用于全基因组精子分析，尤其是对精子基因异常风险较高的患者，如高龄男性、接受化疗的男性和复发性流产的夫妇。
端粒分析
端粒是染色体两端核苷酸序列的一个区域，保护染色体的两端。端粒在维持染色体稳定性和细胞活力方面起着重要的作用。不育男性精子端粒长度较短，与精子数量及IVF后早期胚胎发育质量显著正相关。选择端粒长度正常的精子是治疗不孕症的理想选择。端粒长度的分析通常通过定量FISH（qFISH）和实时聚合酶链式反应（rtPCR）实现。
表观遗传分析
精子表观遗传修饰对精子的产生和早期胚胎发育具有重要的调控作用。其主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA的生成。异常的精子表观遗传修饰与少精子症和胚胎发育不良有关，还有助于预测ART的结果。
甲基化DNA的识别通常通过亚硫酸氢盐转化和甲基化DNA免疫沉淀来实现。组蛋白修饰分析通常使用染色质免疫沉淀（ChIP）进行。精子遗传学的分析已经通过高通量测序（NGS)、rtPCR和RNA测序等技术得到改善，但大多数精子遗传学分析方法破坏精子，使其无法用于不孕症的治疗。
十、精子的分离和选择
精子分析具有相当大的诊断价值，也使精子分离和选择的新技术得以发展。不孕症治疗需要分离精子，因为受精潜力最高的精子需要从原始精液中分离出来。分离出的精子的活力和DNA完整性明显优于原始精液中的精子。为了选择适合不孕治疗的最佳精子，已经发展了几种技术。
例如，设计了一种微流控装置，通过在微通道内加速精子并在出口处收集活动精子来实现精子分选。培养时间为1小时，通道长度为20毫米，精子在出口处的曲线速度比精子在进口处的曲线速度高4.7倍。
例如，通过控制精子培养基的流速，在微流控通道内的畜栏结构前面形成了流变区。在畜栏结构中分离出具有向上游动行为的精子，并研究了流速对离体精子流速的影响。利用流体流动和几何约束，开发了一种模拟女性生殖道内狭窄连接的装置，以防止低活力精子通过约束前进。在体内，透明质酸包裹着卵母细胞，与透明质酸结合的精子表现出成熟、有活力并且具有未反应的顶体状态。透明质酸被用作一个生理精子选择器，与其结合的精子全部存活（染色呈绿色）。
将透明质酸合并到ART中常用的工具有两种：一种是生理性显微授精（PICSI）培养皿，另一种是市售的含有透明质酸的培养基。在PICSI中，培养皿包括固定的透明质酸区域，成熟的精子可以在此结合，然后选择结合的精子用于ICSI。AnnexinV是一种钙依赖的磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸具有高亲和力。利用AnnexinV和磁活化细胞分选（MACS）出更多正常形态的精子。
十一、运动和行为分析
精子的运动是由鞭毛驱动的；因此，鞭毛跟踪是研究精子运动和行为所必需的。精子鞭毛跟踪不同于精子轨迹的测量，后者只跟踪一个点（精子头部的质心）。精子鞭毛跟踪面临的挑战是由于鞭毛的直径小于1μm成像对比度低。因此，鞭毛跟踪需要图像对比度增强。
在3D图像堆栈中，使用分类器预测精子鞭毛的每个像素概率，并将其设置为对比度增强图像中的像素值。对精子鞭毛的定量分析发现，两个具有基频的弯曲波及其二次谐波的叠加沿着鞭毛传播，这种模式是精子鞭毛搏动的特征。通过对比增强图像上的鞭毛跟踪，发现精子速度与其鞭毛搏动幅度成正比。
结果表明，中段的不对称性决定了流变轴转向的方向（左转或右转）。新兴的显微镜方法已经被用来分析精子的行为。精子很少在微通道中部游动，而是沿着通道壁的交叉点游动。在这种游泳模式中，牛精子头部和鞭毛被限制在距离基质1μm以内的一个不旋转的2D平面内，不同于精子头部旋转、鞭毛推进为螺旋推进的3D游行模式。有关精子运动和行为的发现有助于我们理解精子在女性生殖道内的导航，所揭示的行为可用于设计选择高受精潜能精子的方法。
十二、亚细胞和分子结构
超分辨显微镜有足够的分辨率来分析精子的亚细胞和分子结构特征。扫描近场光学显微镜（SNOM）用于分析中段质膜下的精子线粒体组织，揭示线粒体在轴丝周围呈螺旋状分布。线粒体数量少且结构紊乱可导致严重的弱精子症（精子活力降低）或完全丧失活力。沿着精子尾的纤维鞘也观察到了环肋和纵柱的组织和排列。在纤维鞘发育不良的患者中，环肋和纵柱排列不整齐，导致严重的运动障碍和不育。
随机光学重建显微镜（STORM）发现CatSper通道沿着老鼠精子鞭毛呈正态四边形分布，Ca2+信号协调酪氨酸磷酸化和运动。激光发射耗尽（STED）显微镜观察，观察到在顶体反应期间，膜辅助因子蛋白CD46在老鼠精子头部经历动态重组。结构照明显微镜（SIM）发现膜辅助因子蛋白CD46定位于小鼠精子头的顶体内外膜，增加了对顶体反应期间精子头部动态重组的了解。
免疫染色也有助于确定精子生物标志物。如泛素被发现是男性不育的生物标志物。质谱分析人类精子揭示了肽残基的存在，这些残基可能含有翻译后修饰位点。这表明蛋白质修饰是精子成熟的重要机制，其用于鉴定无精子症的生物标志物。附睾表达的细胞外基质蛋白1(ECM1)亦用于区分梗阻性和非梗阻性无精子症。
未来展望
精子分析已取得相当大的进展；目前的许多分析技术都是侵入性的，无法达到分析并直接选择精子治疗不孕症的目的。因此，人们致力于发展无创分析精子的技术。
例如，利用先进的图像处理技术实现了活精子形态的自动测量，可以实时选择形态正常的精子，从而避免传统精子形态测量中的固定和染色。选择DNA完整性高的精子进行不孕症治疗具有潜在的价值。这些基于精子分析的预测模型可以改善男性不育的评估和治疗，有助于为患者选择最佳的ART治疗方案。
精子分析的发现对临床应用具有相当大的转化价值。例如，有关精子在女性生殖道内运动和引导的发现有助于确定男性不育症的病理学，对精子行为的观察可用来选择精子用于不育症治疗。发现参与精子生理过程的分子，如顶体反应，可用于开发用于治疗或避孕目的的增强剂或抑制剂。鉴定出的精子生物标记物可用于选择成熟和正常的精子用于ART。随着更强大的技术的出现，人们对精子行为、生理学和遗传学的理解将得到改善，这反过来将开发更有效的、以机制为目标的诊断和治疗方法。
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