Prostatecancerevolutionfrommultilineageprimarytosinglelineagemetastaseswithimplicationsforliquidbiopsy（前列腺癌从多系原发转移到单系转移的演变与液体活检的关系）
从原发性前列腺癌到转移性前列腺癌的进化过程在很大程度上尚不清楚，液体活检的意义尚不清楚。我们推断了10例患有致命疾病的前列腺癌患者的肿瘤系统发育的详细重建，并结合组织病理学和从血液和脑脊液中提取的肿瘤DNA对其进行了研究。实质性的进化发生在前列腺内，导致分支成多个空间混杂的谱系。一个显性谱系出现，启动和驱动系统性转移，其中位点间的多克隆接种是常见的。不同患者的转移途径不同，转移的可能基因驱动因素将转移谱系与局限于每个患者前列腺的谱系区分开来。体液捕获显性谱系的特征，而在转移期发生的亚克隆扩增是不一致的。脑脊液分析显示血源DNA中未检测到谱系，提示可能的临床应用。
前列腺癌是男性最常见的癌症，占男性所有癌症相关死亡的10%。前列腺内癌症的发展导致高度异质性状态，并伴有多个疾病病灶。这些病灶要么对应于独立起源的肿瘤，要么对应于来自共同肿瘤进化分支的谱系。尽管存在这种前列腺内异质性，但来自我们自己和其他人的证据表明，每位患者的转移瘤具有共同的祖先或单克隆来源。
导致转移潜能的因素尚不清楚。据报道，转移性播撒可发生在前列腺处，或通过转移到转移播撒，通常导致多克隆播撒。在这两种情况下，转移谱系在最初传播后继续进化，导致转移之间的异质性。影响转移谱系的进化压力尚未确定。然而，转移瘤在雄激素剥夺治疗（ADT）后典型地表现出AR扩增的趋同进化。
这些复杂的异质性模式混淆了我们从原始样本准确预测最终转移状态的尝试，从而确定预后和有效治疗策略。事实上，已经证明，在活检时确定的指数病变中看到的基因改变并不总是与转移中的基因改变一致。类似地，液体活组织检查已显示可提供转移性疾病中临床相关标记物的信息，但尚不清楚它们在给定患者中现存肿瘤细胞群的进化路径和整体基因组状态的代表性如何。迄今为止，大多数涉及从多个样本直接重建进化轨迹的前列腺癌研究仅限于局限于局部疾病，或集中于转移后的进化，主要使用转移样本，通常在ADT20之后。前列腺内和前列腺外演变的联合研究仅限于单个患者。
在这项研究中，我们使用深层基因组测序和组织病理学信息来追踪10名男性前列腺内和转移期间的肿瘤演变。从这一详细的追踪中，我们的目的是调和之前的两个观察结果，即多发性转移通常具有单一的单克隆来源，并且在原发性和转移性肿瘤内部和之间观察到相当大的遗传异质性。然后，我们探讨了我们在血液循环肿瘤DNA（ctDNA）以及脑脊液（CSF）和尿液中肿瘤DNA发现的分支。
图1十名男性原发性和转移性前列腺癌进化的系统发育树。
图2不同谱系的亚克隆可在前列腺内空间混合。
图3A22中相邻器官的多克隆侵袭和随后的转移种植。每个样本中鉴定的亚克隆与系统发育树一起考虑，以区分侵袭性局部传播、进化进展和转移性传播的起源。一个复合的系统发育/区室图，其中谱系可以在区室之间移动（虚线，紫色=局部入侵，橙色=远处扩散），并经历亚克隆扩展（黑色实线）。隔室为前列腺、精囊、膀胱和标记的周围。亚克隆由组织类型着色的圆圈表示，数字对应于补充图5中的簇。转移系的扩散首先通过经前列腺转移到前列腺底部，然后转移到精囊，然后转移到膀胱。至少有一个转移谱系（对应于亚克隆2）从膀胱中播种，通过亚克隆4、11和19鉴定的谱系可能起源于膀胱或精囊（表示为起源不确定）。另外一个转移谱系（亚克隆9）似乎是直接从前列腺中获得的。
图4A10中8p21.3-8p21.2位点的拷贝数变化。A10中有2个基因座。8p区域的副本编号配置文件由彩色块显示，其中级别对应于该区域的1、2和3个副本，无颜色表示不存在副本。所有转移样本中杂合性丢失的区域以粉红色突出显示。下面给出了该区域已知驱动因素的基因名称（见方法），上面的条形图详细说明了相应的基因组位置。
图5A32前列腺和神经周围区域内多个部位的可转移细胞。前列腺（中心）被分成13个切片（黑线），三个区域被取样，两个来自切片10，一个来自切片6。紫色圆圈表示新鲜冷冻并测序为样品c的区域，红色圆圈表示乙醇/甲醇固定并石蜡包埋的区域。组织学幻灯片显示在左侧和右侧，显微解剖区域以青色突出显示，并带有相邻的测序样本字母。下窗格显示了喙内进化的系统发育树，圆圈中的数字对应于亚克隆簇，如补充图9所示。将杂合区域连接到亚克隆簇的线表示在每个区域中观察到的最终亚克隆；这些被指定为高（CCF0.5）和低（CCF0.5）比例。
图6组织样本中的亚克隆可通过液体活检获得的DNA进行鉴定。
讨论
这些发现为前列腺癌在前列腺内和转移扩散过程中的演变提供了许多见解。很明显，每一种癌症的发展都有其独特的方式。然而，这些进化轨迹之间有一些共同点。特别是，我们始终观察到在一个显性谱系出现之前，多个前列腺内谱系的发展，该显性谱系产生了许多（如果不是全部的话）随后的转移。这表明转移性增殖相对罕见，可能受到强烈的选择压力。
在这些晚期癌症中，存在广泛的局部疾病。我们发现不同的谱系在前列腺癌的相同区域空间上共存。这些结果与胰腺癌、肾癌、胶质母细胞瘤和肺癌的研究结果形成对比，在这些研究中，亚克隆在空间上是不同的。我们还发现，这种亚克隆混合在侵袭性扩散到局部器官的过程中得以维持。值得注意的是，当观察到扩散到局部器官时，这些谱系并不一定导致远处转移。在胰腺癌32中也观察到类似的行为，腹膜转移定植和远处转移由不同的谱系播撒。如果局部浸润谱系并不总是转移谱系，那么T3期（囊外扩展）可能是晚期疾病的间接标志，而不是转移扩散可能性的直接测量。我们发现大多数驾驶员畸变发生在进化树的主干中。然后出现多个谱系分支，之后一个谱系开始转移性扩张。
因此，转移性和非转移性谱系显示出相对较少的差异，从而能够对个别假定的驱动因素事件进行逐项分类。没有转移的谱系在与转移谱系分离后继续累积额外的驾驶员畸变。这在A31中最为显著，在A31中，非转移性谱系经历了六种不同的已知驾驶员畸变，而转移性谱系中只有两种。这些结果表明，完全的转移潜能不是通过大量驾驶员事件的累积冲击而产生的，而是一组协同畸变的累积。因此，遗传因素，即PPP2R5A杂合缺失或WGD杂合缺失中的一个或两个，可能是A31转移潜能的关键功能步骤。
与原发肿瘤相比，WGD在前列腺癌转移中显著富集的发现进一步证明了这一点。此外，我们还在A10和A32中发现了类似的假定转移触发事件。A10中的转移谱系显示LOH事件的聚合进化，影响覆盖NKX3-1基因的8p小区域，该区域与侵袭性疾病相关。这可能表明该LOH足以引发该患者的转移性播散。在A32中，我们发现所有转移谱系中细胞的MRCA位于前列腺的神经周围区域；这些人经历了CTNNB1错义突变。CTNNB1是一种已知的驱动基因，编码β-连环蛋白，是细胞外基质的一种成分，也是Wnt信号通路的一种成分。神经周围浸润的确切机制尚不清楚，但已经证实Wnt/β-连环蛋白靶点MMP2和MMP9的异常表达导致胰腺癌神经周围浸润的倾向性增加。
这种基因改变有助于传播到神经周围空间，从那里播种到遥远的地方，这似乎是合理的。在这三名患者中，基因改变的累积非常不同，表明没有共同的转移途径。这些结果表明前列腺中的肿瘤进化导致了一种启动状态，在此状态下获得一个关键的基因改变可能会使平衡朝着转移方向倾斜。表观基因或其他未测量的因素也可能有助于这些患者转移潜能的发展。转移性触发事件很可能是罕见的，并且是随机发生的，这意味着很难预测最终转移的谱系。
两名患者出现两次转移潜质。在A34中，与死亡前11年切除的脊髓转移瘤相比，转移到肝脏的谱系在更高的位置（靠近根结）从前列腺内谱系分化。在A24中，乙状结肠浆膜样本中的癌症并非来自导致全身转移的同一谱系。由于对A24s骨盆进行了放射治疗，这种治疗似乎消除了该谱系的转移潜能。这些谱系在这些患者的前列腺中分支后的大量死亡时间（分别至少11年和10年）进一步支持转移潜能的演变是一个罕见的事件。
组织活检和液体活检在评估整体转移状态方面的作用可能有限。由于存在多个前列腺内谱系，从组织活检获得的信息将是不完整的，目前还没有办法确定哪个谱系最有可能转移。然而，进化分支通常先于转移种子的事实意味着异质性可以作为晚期疾病的标志。这可能解释了之前一项研究的发现，该研究表明前列腺中的亚克隆性预示着不良预后。在血液中检测到的ctDNA不能完全代表现存的转移谱系，但在所有病例中，它确实显示出与显性谱系相对应的亚克隆。通过对单个循环肿瘤细胞进行更敏感的分析，可以从更多转移部位识别细胞。尽管如此，转移亚克隆的可变代表性确实表明循环系统肿瘤负担仅起源于转移位点的子集。在两个病例（A24和A34）中，早期在血液中发现的一个谱系的消失似乎是治疗反应的真实指标，这可能有助于设计旨在进化指导肿瘤走向有益结果的临床试验。在脑脊液中发现ctDNA中未发现的转移谱系表明，脑脊液和血液活检相结合可以更准确地评估前列腺癌患者的转移状态。我们的研究强烈表明，尸检和/或多发转移瘤的分析以及液体活检结果对于确定在一般临床实践中何时以及如何使用液体活检至关重要。
该研究的10名受试者在年至年间接受了前列腺癌治疗（补充图1-10）。从无药物治疗（A32的放疗和切除术）到多种类型和强度不同的雄激素操纵和化疗药物。在此期间，前列腺癌的治疗标准发生了变化。然而，他们接受的许多药物，如亮丙瑞林和氟他胺，与目前使用的药物属于同一类。值得注意的是，尽管所接受的治疗不同，但如上所述，他们在前列腺和转移性外周都表现出相似的进化模式。因此，我们相信这一结果将与接受现代治疗的男性相关，而这组经过深入研究的男性可以作为未来研究中比较新型药物在选择性压力下肿瘤演变的基准。
从原发性前列腺癌到转移性前列腺癌的详细演变情况正在出现。相当大的肿瘤内异质性通常来源于前列腺内数年的生长，通过局部浸润扩展到精囊和膀胱。选择通常在遗传水平上起作用，使来自单一谱系的细胞能够逃离前列腺并在远处定居。这一播种事件之后是异质性的重新出现，尽管只是在转移谱系内，但通过多克隆迁移迅速分布在多个位点。
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